O microscópio é o instrumento mais importante para a identificação e compreensão de princípios gerais e características especiais em relação à estrutura das células, tecidos e microrganismos. Assim, os microscópios abrem fronteiras que não podem ser observadas a olho nu. É por esta razão que desempenha um importante papel na ciência, biologia e medicina, fazendo-nos conhecer um mundo que consideramos microscópico.

A microscopia como a conhecemos teve início com Anton van Leeuwenhoek, considerado o “pai da microbiologia”, no século XVII. Suas lentes melhoradas no microscópio simples permitiram visualizar protozoários e bactérias. Algum tempo mais tarde Robert Hooke observou as primeiras células, através da invenção do primeiro microscópio composto, usando dois conjuntos de lentes para obter o aumento na ampliação. Desde então o microscópio vem sendo aperfeiçoado incessantemente.

Manipulação do microscópio óptico

Existem muitos tipos de microscópios, permitindo diferentes níveis de ampliação e produzindo diferentes tipos de imagens. Além disso, variam desde um design básico até os de alta complexidade, que oferecem maior resolução e contraste.

O microscópio óptico é, sem dúvida, o mais utilizado. Todos consistem fundamentalmente em um sistema de duas lentes, uma fonte de luz e partes mecânicas ajustáveis para determinar a distância focal entre as lentes e a amostra.

A maioria dos microscópios ópticos permite uma ampliação de 40x até 1000x. Ele é considerado composto, pois apresenta dois sistemas de lentes: ocular, que fica próximo ao olho do observador e objetiva, próxima à preparação a ser observada. A lente ocular geralmente amplia 10x e uma lente objetiva amplia 40x. A maioria das vezes o microscópio vem com um conjunto de lentes objetivas que podem ser trocadas, variando assim a ampliação.

Para observar a amostra, primeiro você precisa baixar a platina completamente e inserir a lâmina com a lamínula, fixando o objeto com a pinça. Além disso, é preciso se certificar de que o diafragma regule corretamente a quantidade de luz que atinge o campo de visão do microscópio. Na sequência, é preciso selecionar a objetiva de menor aumento e fazer o ajuste macro e micrométrico, olhando através das lentes oculares. Você também pode usar o revólver para mudar para a objetiva seguinte.

Ainda não conseguiu entender como é realizada a observação no microscópio?

Deve ser pelo fato de que a microscopia tem uma terminologia muito específica. Você precisa estar familiarizado com os termos para garantir uma correta manipulação e configuração do equipamento, produzindo assim imagens nítidas.

No nosso post “Microscópio Óptico: Você conhece a sua estrutura e aplicações?” você confere todos os componentes que formam um microscópio. E logo a abaixo, descubra as terminologias mais utilizadas em microscopia.

Terminologias utilizadas na microscopia

Abertura Numérica (N.A.)

A abertura numérica é um fator importante que determina a eficiência do condensador e da objetiva. É representada pela fórmula: (NA = ηsinα), onde η é o índice de refração de um meio (ar, água, óleo de imersão, etc.) entre a objetiva e o espécime ou condensador, e α é metade do ângulo máximo em que a luz entra ou sai da lente de ou para um ponto do objeto focado no eixo óptico.

Ajuste de dioptria

O ajuste da ocular de um instrumento para proporcionar acomodação para as diferenças de visão do observador.

Ampliação

O número de vezes que o tamanho da imagem excede o objeto original. Assim, é a razão entre a distância entre dois pontos na imagem e a distância entre os dois pontos correspondentes no objeto.

Ampliação total

A ampliação total de um microscópio é o poder de ampliação individual da objetiva multiplicado pelo da ocular.

Campo de visão (F.O.V.)

A parte do campo da imagem, que é visualizada na retina do observador, e, portanto, pode ser vista em qualquer momento. O campo de número de exibição é agora uma das marcas padrão da ocular.

Campo de visão real (Real Viewfield)

O diâmetro em milímetros do campo do objeto.

Real Viewfield = Campo de visão da ocular / ampliação da objetiva

Exemplo:

Campo de visão da ocular = 20 mm

Magnificação da objetiva = 10X

Diâmetro do campo do objeto = 20/10 = 2,0mm

Condensador Abbe

Um condensador com duas lentes, localizado abaixo da platina do microscópio, com a função de coletar luz e direcioná-la para o objeto a ser examinado. Sua alta abertura numérica torna-o particularmente adequado para uso com a maioria das objetivas de ampliação média e alta.

Contraste de fase

Uma forma de microscopia que converte diferenças na espessura do objeto e no índice de refração em diferenças na amplitude e intensidade da imagem.

Diafragma

Controla o tamanho efetivo da abertura do condensador, regulando dessa forma a quantidade de luz que entra.

Distância de trabalho

Esta é a distância entre a lente frontal objetiva e a parte superior da lamínula quando o espécime está em foco. Na maioria dos casos, a distância de trabalho de uma objetiva diminui à medida que a ampliação aumenta.

Eixo X

O eixo que geralmente é horizontal em um sistema de coordenadas bidimensional. No microscópio, o eixo X dos estágios da amostra é considerado o que corre da esquerda para a direita.

Eixo Y

O eixo que geralmente é vertical em um sistema de coordenadas bidimensional. No microscópio, o eixo Y dos estágios da amostra é considerado o que corre de frente para trás.

Espessura da lamínula

As objetivas de luz transmitida são projetadas para reproduzir imagens de espécimes cobertos por uma lamínula fina. A espessura desta pequena peça de vidro é agora padronizada em 0,17 mm para a maioria das aplicações.

Filtro

Os filtros são elementos ópticos que transmitem luz seletivamente. Assim, pode absorver parte do espectro, reduzir a intensidade ou transmitir apenas comprimentos de onda específicos.

Micrômetro (μm)

Uma unidade métrica de medida de comprimento.

μm = 1×10-6 metros ou 0.000001 metros

Nanômetro (nm)

Uma unidade de comprimento no sistema métrico.

Nm= 1×10−9 metro ou 0.000000001 metro

Óleo de imersão

Qualquer líquido que ocupe o espaço entre o objeto e a objetiva do microscópio. Esse líquido geralmente é necessário para objetivas de distância focal de 3 mm ou menos.

Poder de resolução

Uma medida da capacidade do sistema óptico de produzir uma imagem que separe dois pontos ou linhas paralelas no objeto.

Profundidade de foco

A profundidade axial do espaço em ambos os lados do plano da imagem dentro da qual a imagem é focada. Portanto, quanto maior a N.A. da objetiva, menor a profundidade de foco.

Resolução

O resultado da exibição de detalhes finos em uma imagem.

Tipos de microscópios ópticos

Há muitos tipos de microscópios ópticos. Podem variar de um projecto muito básico a uma complexidade alta que ofereça mais de alta resolução e o contraste. Alguns dos tipos de microscópios ópticos incluem o seguinte:

• Microscópio simples: uma única lente para ampliar a imagem da amostra, similar a uma lupa.
• Microscópio composto: uma série de lentes para ampliar a imagem da amostra a um mais de alta resolução, mais de uso geral na pesquisa moderna.
• Microscópio de Digitas: pode ter lentes simples ou compostas, mas usos um computador visualizar a imagem sem a necessidade para que um ocular ver a amostra.
• Microscópio estereofónico: fornece uma imagem estereoscopicamente, que seja útil para dissecções.
• Microscópio de comparação: permite a vista simultânea de duas amostras diferentes, uma em cada olho.
• Microscópio invertido: vê a amostra de embaixo, que é útil examinar culturas celulares líquidas.

Outros tipos de microscópios ópticos incluem petrographic, a polarização, o contraste da fase, o epifluorescence, e microscópios confocal.

Imagens

Um microscópio óptico pode gerar uma micrografia usando câmeras sensíveis à luz padrão. O filme fotográfico foi usado tradicional para capturar as imagens.

As revelações tecnologicos têm permitido agora imagens digitais de ser tomadas com CMOS e câmeras do dispositivo (CCD) dos carga-pares para microscópios ópticos. Em conseqüência, a imagem pode ser projectada em um ecrã de computador no tempo real examinar uma amostra com estes microscópios digitais. Isto aumenta a conveniência do uso porque os ocular são já não necessários.

A potência da ampliação de um microscópio óptico composto depende da ocular e das lentes objetivas. É igual ao produto das potências destas lentes (por exemplo para uma lente da ocular 10x e a lente 100x objetiva usadas junto, a ampliação final é 1000x.)

Operação, aplicações e limitações

A fim usar eficazmente um microscópio óptico, é importante assegurar-se de que o microscópio se estabeleça correctamente.

A lente objetiva deve ser trazida perto da amostra do estudo para permitir a luz dentro da câmara de ar do microscópio. Isto cria uma imagem ampliada, invertida da amostra, que pode ser vista através do ocular do microscópio.

A microscopia óptica é de uso geral em muitas áreas de pesquisa que incluem a microbiologia, as microeletrônica, o nanophysics, a biotecnologia e a pesquisa farmacêutica. Pode igualmente ser útil ver as amostras biológicas para diagnósticos médicos, conhecidas como a histopatologia.

Há alguns exemplos quando a microscopia óptica não é boa - serido ao à mão da tarefa devido às limitações da técnica. Por exemplo, em ampliações muito altas os discos pairosos podem ser visíveis, que são discos distorcido cercados pelos anéis de difracção, que aparecem no lugar dos objetos do ponto.

Quando as limitações da microscopia óptica são significativas, os tipos alternativos de microscopia podem ser mais úteis.

Tipos alternativos de microscopia

Há diversos outros tipos de microscopia que podem ser usados como alternativas à microscopia óptica. Estes incluem:

• Microscopia de elétron da exploração
• Microscopia de elétron de transmissão
• Microscopia de fluorescência
• Microscopia atômica da força
• Microscopia da condutibilidade do íon da exploração
• Microscopia de varredura da escavação de um túnel
• Microscopia ultravioleta
• Microscopia do raio X

Ao contrário da microscopia óptica, estes tipos de microscopia não usam a luz visível para ver a amostra.

Bom, a Histologia, como o nome já diz, é o "estudo dos tecidos" com base em lâminas histológicas visualizadas em aparelhos chamados microscópios, sendo mais comum o microscópio óptico (Fig.1). Vamos começar então, entendendo como é o processo de preparação dessas lâminas.

O tecido a ser analisado deve ser preparado para permitir a passagem da luz através dele e a visualização de estruturas específicas através da aplicação de corantes específicos. O processo de preparação das lâminas é dividido em cinco etapas: fixação, desidratação e diafanização, inclusão, microtomia e coloração.

1. Fixação:

Após a coleta da amostra biológica (biópsia, necrópsia ou peças cirúrgicas), deve-se primeiramente fixá-la com o objetivo de manter a estrutura e a composição mais próxima a do tecido in vivo e impedir a ação de bactérias e enzimas proteolíticas (autólise) que provocariam a degradação tecidual. A fixação pode ser realizada por métodos físicos (aquecimento, resfriamento) ou por métodos químicos (formol, líquido de Bouin). Os fixadores atuam estabelecendo ligações transversais entre as proteínas intra e intercelulares. Quando a amostra é espessa, realiza-se, a sua clivagem para permitir a melhor penetração do fixador. Outra peculiaridade está em amostras de tecido mineralizados, que precisam ser descalcificados para permitir a sua fixação.

2. Desidratação e diafanização:

Fixada a amostra, procede-se a sua desidratação através de banhos de álcool em concentrações crescentes, de etanol 70% a etanol 100%. Após a desidratação, realiza-se a sua diafanização ou clareamento com a finalidade de substituir o etanol presente na amostra por um substância intermediária que seja miscível tanto em etanol como na substância utilizada na etapa seguinte (inclusão) para enrijecer a amostra. Essa substância intermediária é o xilol . Ao final desta etapa, os tecidos se tornam transparentes.

3. Inclusão:

Após a diafanização, a amostra é colocada em parafina (microscopia de luz) ou em resina (microscopia de luz e eletrônica) a fim de torná-la rígida e, dessa forma, permitir o corte em lâminas finas no micrótomo. Ao ser imersa em parafina fundida e colocada em uma estufa a 58-60°C, o calor promove a evaporação do xilol e a ocupação dos espaços teciduais por parafina. O tecido embebido por parafina se torna rígido após ser retirado da estufa. Uma das vantagens da resina em relação à parafina é que aquela produz menos artefatos, gerados pela alta temperatura da estufa.

4. Microtomia

Na penúltima etapa, os blocos de tecido são levados ao micrótomo para serem cortados em cortes finos de 1 a 10µm. A microtomia também pode ser efetuada em espécimes congelados, seja em nitrogênio líquido seja por congelamento rápido, no braço de um criostato a -20°C com uma lâmina de aço pré-resfriada.

5. Coloração

As lâminas são, em seguida, coradas com corantes específicos para que possam ser visualizadas e diferenciadas as estruturas específicas que se quer observar. Os corantes são hidrossolúveis e podem ser acidófilos ou basófilos. Os corantes basófilos são básicos e coram estruturas teciduais ácidas como os ácidos desoxirribonucléico (DNA) e ribonucléico (RNA), o núcleo e os ribossomos. Como exemplo de corantes basófilos, destacam-se a Hematoxilina, o Azul de Metileno e o Azul de Toluidina. Os corantes acidófilos são ácidos e coram estruturas teciduais básicas como as mitocôndrias, os grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno. Como exemplo de corantes acidófilos, destacam-se a Eosina, Orande G, Fucsina ácida.

A combinação mais utilizada é a de Hematoxilina com Eosina (HE). A Hematoxilina cora em azul ou violeta e a Eosina, em cor-de-rosa. Outros corantes utilizados são os tricrômios (corantes de Mallory e Masson), importantes na diferenciação entre colágeno e músculo liso. Além deles, a impregnação por metais, como a prata e o ouro, é comum no estudo de tecido nervoso.

Postado por Pérside Pinheiro às 15:52

A técnica histológica visa a preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.

Visão Geral do Processamento de Tecidos

Os tecidos a serem processados para estudo ao microscópio devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura original ao máximo possível. Entretanto, isso não é possível e todos os preparados apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas. Podemos resumir os passos das técnicas histológicas com a seguinte seqüência: fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte em fatias finas), coloração e montagem de lâminas. Essas etapas serão descritas adiante.

OBTENÇÃO DO MATERIAL E FIXAÇÃO

Uma boa preparação histológica se inicia com o uso correto das técnicas de obtenção do material. Os cuidados devem ser observados já no sacrifício dos animais de laboratório para o estudo histológico de seus tecidos. Em se tratando de animais de laboratório o sacrifício pode ser obtido através de técnicas como, traumatismo brusco, intoxicação (overdose de anestésico) e perfusão/imersão.

Objetivos da fixação

A fixação paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os tratamentos posteriores. A fixação evita a autólise celular, impede a proliferação de microorganismos, leva ao endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos posteriores. O fixador deve causar o mínimo de dano ao tecido e produzir o mínimo de artefatos. A escolha adequada da solução fixadora irá variar de acordo com o material que irá ser usado para a inclusão. A solução de glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 ou a solução “formalina neutra tamponada” (NBF) são comumente usadas. Os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos aminos das proteínas, através de pontes de hidrogênio. O glutaraldeído possui dois grupos aldeídos um em cada extremidade de sua estrutura molecular que podem estabelecer pontes de hidrogênio entre as proteínas. As moléculas de formaldeído, no entanto, possuem apenas um grupamento aldeído, sendo um fixador menos eficiente para alguns tipos de proteínas.

A técnica da perfusão para lavagem e fixação do tecido.

Usando anestesia profunda, em ratos e camundongos por exemplo, uma técnica que resulta em boas preparações consiste na perfusão cardíaca. Este método simula o funcionamento do sistema circulatório, uma vez que injeta os vasos do espécime com soluções químicas e perfunde os tecidos. O processo consiste inicialmente na retirada da circulação sanguínea através de lavagem feita com uma solução salina de pH neutro. Posteriormente, processa-se então a fixação através da injeção de solução fixadora. Em ambos os casos, as soluções são impulsionadas nos vasos através de tubos que se conectam à uma bomba peristáltica e à um grande vaso do animal a ser perfundido, com o arco aórtico por exemplo. Neste ponto, é importante regular a pressão de injeção da solução, que não pode exceder a pressão do sangue, pois de outro modo, artefatos por fixação são produzidos. Outro fator importantíssimo para que a técnica da perfusão seja bem sucedida é a ausência de sangue coagulado nos vasos. Para evitar esse imprevisto, é conveniente administrar heparina diluída a 1:50 (Liquenine) ao animal 10 minutos antes da etapa de sacrifício. A filtração criteriosa das soluções também é um cuidado que evita a obstrução dos pequenos vasos e o consequente iimpedimento do fluxo da solução através dos tecidos.

A técnica de fixação por imersão

Além da perfusão cardíaca, pode-se também recorrer à fixação por imersão, ainda muito utilizada. O volume de fixador empregado deve ser 15 a 20 vezes maior que o volume do fragmento de tecido a ser fixado. O fixador inicia a sua ação da periferia para o centro do material. As porções periféricas do material são primeiramente fixadas em relação as suas porções mais internas. A boa penetração de qualquer fixador está diretamente relacionada ao tamanho e espessura do material. Entretanto, de acordo com o tipo de tecido, com a fixação de um encéfalo, por exemplo, a fixação por imersão seria um método condenável, devido à dificuldade de penetração da solução. Para estes casos sugere-se recorrer ao método da perfusão.

Protocolo Soluções

DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA

Objetivos

Para a observação ao microscópio de luz a espessura da secção do tecido presente em uma lâmina deve ser delgada o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de luz. Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para receber um meio endurecedor, ou seja meio de inclusão. Desta forma será possível a obtenção de cortes delgados, obtidos no processo de microtomia.

Tipos de inclusões e a importância da desidratação

A inclusão pode ser feita utilizando a parafina (mais comumente usada) e as resinas plásticas, como o glicol metacrilato. Após a fixação com as soluções aquosas de glutaraldeído ou formalina, os tecidos devem ser desidratados, uma vez que a água presente nos tecidos não é miscível em substancias apolares como a parafina e as resinas de inclusão. A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções alcoólicas em concentrações graduais e crescentes. A graduação pode ser iniciada, se necessário, a partir de 50% e terminando finalmente em álcool absoluto. A graduação nas concentrações é imprescindível para que ocorra a desidratação homogênia dos tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.

Algumas particularidades podem ser citadas quanto ao material de inclusão. caso de parafinas, o tecido deve ser tratado com uma substância de transição. A inclusão em parafina é precedida pelo uso de substâncias químicas como o xilol, este miscível tanto em álcool quanto em parafina. Após a remoção do álcool, o tecido passa por uma infiltração em parafina líquida, esta mantida em estufa a 56°C (ponto de fusão) e posteriormente o mesmo é transferido para o molde contendo parafina líquida. Em poucos minutos a parafina endurecerá e obter-se-á portanto, o "bloco" de parafina contento o fragmento do tecido em seu interior. No caso da inclusão em resina como o glicol metacrilato, o tecido é infiltrado com uma resina de infiltração por uma noite, e então incluído no molde contendo a resina ainda líquida, sendo que esta endurece após algumas horas. Como no caso da parafina, após o endurecimento, obtém-se um bloco de resina que contém o fragmento de tecido em seu interior. Os blocos serão a partir desta etapa levados para a microtomia e consequente obtenção das secções, que serão então coletadas em lâminas de vidro. No caso de inclusão em parafina, após a microtomia, o tecido é tratado com xilol novamente para remoção da parafina e rehidratado, para que possa ser submetido à coloração.

Protocolo de inclusao para parafina e metacrilato

COLORAÇÃO

Objetivo da coloração

Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a microtomia. A coloração visa contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos corantes se baseia na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos mesmos com os dos tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como será descrito adiante.

Corantes Ácidos e Básicos

Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que carrega uma carga positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido. Corantes básicos reagem com componente aniônicos das células e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das proteínas. A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basofilia, estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas. Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul. Corantes ácidos reagem com componentes catiônicos das células e tecidos. Quando usados juntamente com corantes básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmáticos e fibras extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.

Outros exemplos:corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e orange G; básicos: azul de metileno, verde metil e azul de toluidina.

Outras técnicas de coloração

Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar características estruturais, mas eles não são capazes de revelar todos componentes celulares. Outras técnicas de coloração são disponíveis para evidenciar diferentes componentes.

Coloração pela prata – Algumas substâncias intra e extracelulares promovem a redução do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras reticulares dos linfonodos, por exemplo.

Associação de corantes - É a somatória de corantes diferentes, como o Tricrômico de Gomori, que usa verde luz, cromotropo 2R e hematoxilina

Após a coloração as lâminas são montadas ou seja, os fragmentos são protegidos pela cobertura com lamínulas de vidro. Esta é colada na lâmina através de substâncias selantes como por exemplo o Entellan. Após a secagem, as lâminas podem ser observadas ao microscópio de luz.

Protocolo para coloracao

http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/plantilla.asp?zona=modtecni

Realizar aulas diferenciadas nem sempre é uma tarefa fácil. Entretanto, em escolas que contam com um laboratório voltado para as aulas de Ciências e Biologia, é possível realizar uma maior quantidade de atividades práticas.

Infelizmente, algumas vezes, as escolas contam com microscópio, mas não possuem lâminas permanentes para a observação. Nesses casos, é papel do professor montar suas próprias lâminas para Microscopia.

→ Como preparar uma lâmina para Microscopia

Algumas lâminas são extremamente fáceis de se preparar; outras, no entanto, necessitam de uma estrutura laboratorial mais complexa. A seguir ensinaremos a técnica básica para a preparação de lâminas para a Microscopia. A partir desse procedimento, o professor será capaz de criar outras lâminas além das ensinadas aqui.

Para preparar a lâmina para Microscopia, precisaremos dos seguintes componentes básicos:

• Lâmina para microscópio;
• Lamínula;
• Água;
• Material biológico a ser observado.

Com apenas esses componentes, é possível observar uma variedade de estruturas. Veja alguns exemplos:

→ Lâmina para observar cloroplastos

Você pode preparar uma lâmina para observar cloroplastos da seguinte maneira:

1. Inicialmente pegue uma lâmina e coloque uma folha de elódea (encontrada em lojas que vendem materiais para aquários) ou um folíolo de musgo;
2. Coloque uma gota de água sobre essas estruturas;
3. Cubra o material com a lamínula.

Com essa simples lâmina, é possível observar cloroplastos nas células sem nem mesmo ser necessária a utilização de corantes. Vale destacar que as folhas a serem observadas devem ser finas como as aqui recomendadas ou devem ser feitos cortes, que podem ser realizados com lâminas para barbear, por exemplo.

Os cloroplastos são organelas encontradas apenas em células vegetais, sendo muito importantes para o processo da fotossíntese.

Os cloroplastos são encontrados nas células das algas e plantas. São organelas que apresentam a cor verde, em razão da presença da clorofila em seu interior. Alguns autores classificam os cloroplastos como sendo um tipo de cromoplasto (chrôma = cor), por perderem a clorofila e armazenarem carotenoides, como ocorre no amadurecimento de alguns frutos, que, depois de amadurecidos, apresentam a cor laranja, vermelha ou amarela.

Os cloroplastos, assim como as mitocôndrias, apresentam DNA próprio, RNA e ribossomos que sintetizam uma parte de suas proteínas. A outra parte é sintetizada pelo DNA celular.

Essas organelas medem cerca de 4µm de comprimento por 2µm de espessura e são envolvidas por duas membranas lipoproteicas, que possuem em seu interior um complexo membranoso formado por pequenas bolsas discoidais achatadas e empilhadas que chamamos de tilacoides (thýlakos = saco). Cada pilha de tilacoide é chamada de granum (grão, em latim). Na euglena os cloroplastos são constituídos por três membranas lipoproteicas, enquanto nas algas diatomáceas e algas marrons o cloroplasto possui quatro membranas.

O espaço interno do cloroplasto é preenchido com o estroma, um fluido semelhante ao encontrado na mitocôndria que contém enzimas, DNA, RNA e ribossomos.

As moléculas de clorofila encontradas no cloroplasto são as mais abundantes e ficam dispostas nas membranas internas da organela. Assim, captam a luz do sol com a máxima eficiência, pois é da luz solar que provém a energia necessária para o processo da fotossíntese. A clorofila confere a cor verde às folhas dos vegetais e é capaz de absorver energia luminosa e transformá-la em energia química, que será utilizada no metabolismo.

Cada célula dos vegetais possui cerca de 40 cloroplastos, enquanto as células das algas possuem geralmente apenas um cloroplasto, mas com tamanho bem maior do que o encontrado nas células vegetais.

Por Paula Louredo

Graduada em Biologia

→ Lâmina para observar grão de pólen

Para montar uma lâmina para observar o grão de pólen, a técnica é também bastante simples:

1. Inicialmente pegue uma lâmina e coloque sobre ela alguns grãos de pólen retirados da antera de uma flor;
2. Coloque uma gota de água sobre os grãos;
3. Cubra o material com a lamínula.

Com essa lâmina, é possível observar os grãos de pólen de uma flor, que se apresentam, normalmente, arredondados e amarelados. Vale destacar que os grãos variam de uma espécie para outra.

Encontrado nas plantas fanerógamas, e também chamado de micrósporo, o grão de pólen ainda não é o gameta masculino. O gameta masculino será formado dentro do saco polínico, quando o núcleo reprodutivo se dividir formando anterozoides. No interior dos sacos polínicos ocorre a formação de microsporócitos, também chamados de células-mãe de grãos de pólen. Essas células se dividem formando células haploides, que se diferenciam em grãos de pólen.

Geralmente os grãos de pólen são pequenos e arredondados e apresentam estruturas que o protegem e facilitam a sua aderência ao estigma da flor. Cada espécie vegetal fanerógama tem uma forma de grão de pólen, dependendo da sua principal forma de polinização.

Para a observação dos grãos de pólen, o professor vai precisar de:

• Microscópio;
• Flores de variadas espécies;
• Lâminas e lamínulas;
• Pincel pequeno;
• Um conta-gotas;
• Água
• Potinho de plástico (pode ser um potinho de iogurte vazio).

Montagem do material para observação:

Colocar água no recipiente pequeno.

Com o pincel pequeno, coletar o pólen das flores e colocá-lo no potinho de plástico.

Com o conta-gotas, retirar uma amostra da água com grãos de pólen.

Colocar a água do conta-gotas em uma lâmina.

Cobrir a lâmina com uma lamínula e levar para observação no microscópio.

P.S.: É bom observar também os grãos de pólen a seco.

À medida que os alunos forem observando as lâminas ao microscópio, peça que desenhem os diferentes tipos de grãos de pólen que forem vendo. Na observação de grãos de pólen, o professor terá a oportunidade de mostrar aos alunos as diferentes formas de grãos de pólen, além de caracterizar as formas de polinização e a importância dos polinizadores para o processo de polinização na produtividade agrícola.

Paula Louredo

Graduada em Biologia

→ Lâmina para observar células da boca

Diferentemente das lâminas acima, as lâminas para observar células da boca necessitam de corante. O procedimento, no entanto, também é bastante simples. Veja só:

1. Inicialmente raspe levemente o interior da boca com um cotonete;
2. Posteriormente, passe o material coletado sobre uma lâmina;
3. Coloque uma gota de corante azul de metileno;
4. Cubra o material com a lamínula.

Observe que, apesar do uso do corante, o procedimento é o mesmo daqueles citados anteriormente. A partir dessa ideia básica, é possível observar outras estruturas no microscópio, como micro-organismos presentes em uma gota de água.

Atenção:Lembre-se de que, para observar uma estrutura no microscópio, deve haver passagem do feixe de luz. Assim sendo, materiais muito grossos são impossíveis de serem visualizados, sendo necessária a realização de cortes.

Por Ma. Vanessa dos Santos

Protozoários são seres eucariontes, unicelulares e heterotróficos. Alguns podem ser patogênicos, como os causadores da doença de Chagas e da toxoplasmose. Entretanto, há várias espécies de vida livre que podemos, inclusive, cultivar, a fim de trabalharmos em aula prática de laboratório.

Para tal atividade, serão necessários:

- Conta-gotas;

- Recipiente para cultivo;

- Algumas folhas de alface;

- Lâminas;

- Lamínulas;

- Microscópio;

- Clara de ovo;

Para cultivo, colocar água e algumas folhas de alface no recipiente. Este deve ficar exposto por, aproximadamente, uma semana.

Após este período, já poderão observar alguns microorganismos na água.

Com auxílio de pipeta, colocar uma gota da infusão na lâmina e cobri-la com lamínula.

Os protozoários já poderão ser visualizados ao microscópio.

Dicas:

Peça para que seus alunos identifiquem e desenhem as formas de vida encontradas. Com auxílio deste catálogo, eles terão condições de identificar quais tipos encontraram.

Permita com que todos seus alunos vejam todos os tipos de protozoários que forem visualizados, encaminhando-os para os microscópios específicos.

Faça-os observar a locomoção e estruturas que estes possuem para tal.

Para melhor acompanhamento dos movimentos destes organismos, adicionar uma gota de clara de ovo na lâmina, antes de colocar a lamínula.

Ao final da atividade, peça para a semana seguinte um relatório contendo introdução, os procedimentos da aula, protozoários encontrados (com desenho), seus sistemas de locomoção e classificação (ciliados, amebóides, flagelados ou esporozoários), de acordo com as características observadas.

Por Mariana Araguaia

Equipe Brasil Escola

Preparação temporária

Existem várias técnicas para a realização de preparações temporárias. Em laboratório, nós usamos a técnica de montagem (considerada como complemento de outras) e a técnica de esmagamento.

De acordo com a sua duração, as preparações podem ser designadas como preparações temporárias ou definitivas. As preparações temporárias são aquelas cuja duração é curta e que permitem a observação de células no seu meio natural de vida, por exemplo: água salgada, soro fisiológico, água doce ou plasma sanguíneo. A sua curta duração explica-se pela possibilidade da ocorrência de evaporação do meio aquoso, acompanhada por decomposição e autólise da célula.

A constituição das preparações temporárias é a seguinte:

1. Lâmina de vidro, onde é colocado o objeto para posterior observação;

2. Lamínula de vidro, de espessura mais fina comparativamente à lâmina, colocada sobre o objeto a observar;

3. Meio de montagem: líquido (incolor ou não) que é colocado entra a lamínula e a lâmina e onde o qual deve estar imerso o material;

4. Objeto, que é o material biológico a ser observado no microscópio.

Técnica de montagem:

O objeto é colocado entre a lâmina preparada e a lamínula. Com a ajuda de uma agulha de dissecação, se necessário, deixa-se cair a lamínula lentamente.

Esfregaço sanguíneo é uma técnica que permite a separação de células em meio líquido. Consiste em espalhar um fragmento de tecido ou de uma colônia sobre uma lâmina de vidro, o que provoca a dissociação de alguns elementos celulares e a sua aderência ao vidro. Forma-se assim uma fina camada de células, facilitando a observação.

Este método é usado na observação de sangue e outros líquidos orgânicos, em que se coloca uma gota do líquido sobre uma lâmina preparada, e com a ajuda de uma outra lâmina ou lamela se espalha bem. Depois de seco o material pode ser corado e fixado.

A confecção do esfregaço sanguíneo é o ponto crucial para a realização de um hemograma confiável e por isso a sua padronização deve ser a principal exigência. Para realizar a técnica dos esfregaços sanguíneos, é utilizada uma lâmina limpa, sem resquícios de gordura ou outros materiais e outra lâmina distensora igualmente limpa. O esfregaço ideal deve ser livre de falhas e paradas, não muito espesso, nem fino demais e sem falhas na cauda. Na observação ao microscópio às duas bordas onde são realizadas as contagens devem apresentar os eritrócitos mais separados e os leucócitos bem distribuídos.

Material: Lanceta ou agulha de injeção, papel filtro, álcool e lâminas lavadas com álcool e secas.

Amostra: Obtêm-se por punção da polpa do dedo com uma lanceta previamente desinfetada. A colheita de sangue será feita levando-se em consideração que a gota de sangue extraída deve ser encostada na lâmina invertida, que só toca na gota emergente, evitando assim o contato com a pele.

Técnica:

a) Trabalhar sobre superfície plana e horizontal.

b) Colocar uma pequena gota de sangue na parte central da lâmina de vidro a 1,5 cm da extremidade fosca ou da etiqueta.

c) Colocar a Lâmina com a face para cima sobre a superfície plana.

d) Com a borda estreita da lâmina em contato com a gota de sangue, formando um ângulo de 50º, espalhar o sangue com um movimento rápido, para formar uma camada delgada de sangue sem atingir a extremidade da lâmina.

e) Deixar secar na mesma posição horizontal.

f) Usar etiqueta adesiva para identificação.

g) O sangue pode ser espalhado também da seguinte maneira: Retirar com a extremidade da própria lâmina espalhadora a gota de sangue. Colocar a extremidade que contém o sangue em contato com a parte central da lâmina em posição horizontal e antes que o sangue, por capilaridade, atinja as bordas laterais da lâmina espalhadora formando um ângulo de 50º, faz-se o deslocamento rápido para formar a camada fina de sangue sem atingir a extremidade da lâmina.

Introdução

A observação de células da mucosa bucal no microscópio óptico em lâminas preparadas na sala de aula é uma pratica simples, mas que permite conhecer com maior clareza a organização celular básica: membrana, citoplasma e núcleo. O objetivo do experimento é permitir aos alunos a observação de células da mucosa bucal em lâminas preparadas.

Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de investigação. O microscópio óptico, também chamado microscópio de luz, possibilitou o descobrimento das células. Com os avanços tecnológicos, já existem diversos estudos que demonstram de forma completa a composição celular.

O estudo microscópico de células vivas é possível, mas existe mais vantagens em se obter lâminas preparadas nas quais as células ficam preservadas, fixadas e coradas, para melhor demonstração dos seus componentes. Um preparado permanente ideal deveria mostrar as células com a mesma estrutura microscópica e composição química que possuíam quando vivas. Isso, entretanto, não é possível e todos os preparados apresentam componentes que são alterações produzidas nas células pelas técnicas fixação utilizadas.

Materiais Utilizados:

observação de saliva – materiais

a. Microscópico Óptico;

b. Pinça;

c. Lápis;

d. Lâmina;

e. Lamínula;

f. Swab;

g. Becker;

h. Álcool 70%;

i. Papel Filtro;

j. Corante (azul de metileno);

k. Material-Amostra da Mucosa Bucal.

Experiência

A experiência realizada é a coleta do material da mucosa bucal, o material é coletado com o swab e colocado em uma lâmina de vidro adicionando-se o corante (azul de metileno) o material da amostra presente na lâmina preparada preso por uma lamínula de vidro; Posicionando-se a lâmina preparada no microscópio óptico observa-se o material com a objetiva de 4x de aumento, depois observa-se o material com a objetiva de 10x de aumento e 40x de aumento.

Resultados

No experimento realizado observaram-se as células da mucosa bucal;

O material que encontra-se espalhado na lâmina preparada, porém consegue-se observar com nitidez a célula da mucosa bucal com aumento de 40X;

O corante azul de metileno mostrou-se de grande ajuda para destacar as membranas e o núcleo;

Abaixo está um esboço em desenho da visualização das células com as lentes de 40 vezes de aumento.

Discussão

Um experimento em laboratório realizado permite aos alunos observarem células de forma real analisando a estrutura celular com mais nitidez. Devido ao aumento alcançado com as lentes objetivas, vemos com mais nitidez nas lâminas preparadas as células mostradas no microscópio.

Conclusão

a. A partir do experimento realizado em laboratório conclui-se que:

b. A aula prática em laboratório facilita o aprendizado do aluno;

c. Experimentos de analises de células podem ser utilizados em sala de aula;

d. O manuseio de microscópios é importante para o aprendizado do aluno;

e. A facilidade de observar as células e suas características;

f. Aprimorar os conhecimentos sobre a célula bucal.

Tecnologista do Laboratório de Patologia há 27 anos, Luzia Caputo participa dos cursos de capacitação promovidos pelo IOC há mais de duas décadas e assina o roteiro do filme ao lado do pesquisador Pedro Paulo de Abreu Manso. Conhecedora dos desafios e das demandas da categoria, ela aponta os erros básicos que os tecnologistas cometem. “Já vi tecidos acondicionados em água e soro fisiológico, que não preservam, ou em formol puro, que danificam. A falha mais comum diz respeito à quantidade insuficiente de líquido fixador. É regra básica que o volume deve ser 20 vezes maior do que o da amostra”, explica.

A falta de domínio da técnica pode invalidar a amostra, submetendo o paciente a mais procedimentos.

Ela faz, ainda, uma ressalva: os histo tecnologistas não são os únicos profissionais responsáveis pela manipulação dos materiais. Em cirurgias para biópsia, por exemplo, técnicos de enfermagem, enfermeiros ou o próprio médico realizam os procedimentos de preservação e fixação do tecido. “Se a pessoa não recebeu treinamento ou se aquela tarefa não faz parte de sua rotina, as chances de cometer um erro são ainda maiores”, afirma. Atribuir a função do histo tecnologista a outros profissionais é um dos diversos problemas acarretados pela falta de regulamentação do setor. Embora existam mais de nove mil pessoas trabalhando como técnicas em histologia, a profissão ainda não é reconhecida pelo Ministério do Trabalho.

Segundo o presidente da Sociedade Brasileira de Histo tecnologia (SBH), Joaquim Soares de Almeida, o projeto de lei nº 2090/91, que contempla as reivindicações da classe, está em tramitação em Brasília. Para Almeida, a falta de uma regulamentação também abre brechas para que empresas e laboratórios contratem pessoas sem capacitação para exercer as atividades de técnico sob funções como laboratorialista ou analista de laboratório. “Muitas vezes, essas empresas não têm estrutura e, além de prestarem um mau serviço, submetem seus funcionários a riscos biológicos e químicos, que eles nem sabem que estão correndo”, assinala. De acordo com Luzia, até mesmo os laboratórios e centros de pesquisa comprometidos com a qualidade têm dificuldades para contratar técnicos capacitados. “A saída é chamar biólogos e biomédicos, profissionais que tampouco receberam a formação adequada para exercer a função”, analisa.